Прогресс в изучении стволовых клеток позволяет разрабатывать принципиально новые способы терапии многих трудноизлечимых заболеваний. Например, получая пациент-специфичные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) и затем, проводя их направленную дифференцировку, можно получить многие типы соматических клеток человека и использовать их как аутогенный материал для трансплантации.
В то же время пациенты, с заболеваниями печени, почек, поджелудочной железы на поздних стадиях могут быть излечены только путём трансплантации донорских органов, количество которых крайне ограничено. В связи с этим производство органов или их аналогов из аутогенных клеток является одной из важнейших целей медицины. Тем не менее, реализация этой задачи крайне сложна, прежде всего, из-за отсутствия эффективных методов воспроизведения in vitro взаимоотношений клеток и тканей в процессе органогенеза. Принципиально иным перспективным подходом является получение аутогенных органов in vivo путём комплементации мутантной бластоцисты животного плюрипотентными клетками пациента. В первых экспериментах подобного рода в бластоцисты мыши, мутантные по гену Pdx1, необходимого для развития клеток поджелудочной железы, инъецировали нормальные бластомеры крысы. У полученных межвидовых химер развивалась нормальная поджелудочная железа, состоящая из клеток крысы, то есть происходило заполнение пустующей ниши развития соответствующего органа [3]. Таким же образом была получена почка крысы [4]. В перспективе, для аналогичного получения органов человека необходимы организмы крупных млекопитающих, для которых разработаны методики манипуляции с эмбрионами, например, свиней.
Группа исследователей под руководством профессора Хиромицу Накаучи (Hiromitsu Nakauchi) из Центра биологии стволовых клеток и регенеративной медицины Университета Токио (University of Tokyo), недавно сообщила о получении с использованием технологии комплементации мутантной бластоцисты аллогенной поджелудочной железы in vivo в организме свиньи.
Исследователи ввели в геном зародышей свиньи генетическую конструкцию, нарушающую развитие поджелудочной железы, затем получили и отобрали трансгенные плоды, некоторые из которых в силу правильной работы трансгена были полностью лишены поджелудочной железы. Таким образом, в результате этих генно-инженерных манипуляций впервые были получены организмы свиней со свободной нишей развития отдельного органа. Из одного мутантного плода мужского пола с отсутствующей поджелудочной железой получили культуру соматических клеток, использовавшихся для выделения ядер. В дальнейшем мутантные эмбрионы в нужном количестве размножали путём клонирования (см. рис.). Мутантный фенотип полностью повторялся у клонированных плодов, что указывает на стабильную работу трансгена.
Затем исследователи провели внутривидовую комплементацию мутантных бластоцист свиньи. В клонированные мутантные зародыши мужского пола на стадии морулы инъецировали бластомеры нормальных зародышей женского пола, экспрессирующих оранжевый флуоресцентный белок (белок humanized Kusabira-Orange, huKO) (см. рис.). Химерные бластоцисты переносили в матку самкам-реципиентам, где они нормально развивались вплоть до рождения. Развитие химерных свиней происходило по мужскому типу, они имели морфологически нормальную поджелудочную железу стандартного размера, с хорошо развитыми ацинусами, системой протоков и островками Лангерганса. Практически все клетки поджелудочной железы у химерных свиней экспрессировали huKO и, следовательно, происходили от инъецированных нормальных бластомеров, а мутантные бластомеры не принимали участие в развитии поджелудочной железы, тогда как остальные органы имели химеризм на уровне 40-60%. Здоровые химерные самцы были фертильными в скрещиваниях с нормальными самками, при этом в образовании гамет участвовали только мутантные клетки с кариотипом XY (см. рис.). Половина потомства от скрещивания химерных самцов с нормальными самками несла мутацию и имела мутантный фенотип, и, следовательно, сперма химерных самцов в сочетании с искусственным оплодотворением может быть использована в дальнейшем как наиболее доступный источник мутантных эмбрионов свиньи для комплементации.
В исследовании группы под руководством Хиромицу Накаучи продемонстрирована принципиальная возможность получения функционального органа из аллогенных плюрипотентных клеток в организме крупного животного, что является важным шагом к созданию in vivo органов человека, пригодных к трансплантации. Следующим шагом будет проверка возможности получения органов в организме свиньи из ксеногенных плюрипотентных стволовых клеток, в частности иПСК. Проблема заключается в том, что плюрипотентные стволовые клетки млекопитающих, за исключением мыши и крысы, как правило, имеют особый статус плюрипотентности, свойственный стадии эпибласта, и не могут включаться в развитие химерного организма [5]. Таким образом, задачей на ближайшее будущее будет получение у крупных млекопитающих, например, обезьяны, плюрипотентных стволовых клеток, обладающих способностью к формированию химер, и разработка протокола использования этих клеток для комплементации мутантных бластоцист свиньи. Создание межвидовых химер человека с животными встречает также этические затруднения, связанные, например, с возможностью образования у химерных животных человеческих гамет. Для решения этих проблем необходимо разрабатывать способы контроля путей развития клеток в составе межвидовых химер.
